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熒光PCR

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Real Time PCR技術最早報告在1991年,是由日本人Hihuchi提出的。當時他的想法就是想實時觀察PCR反應的全過程,最終達到檢測樣品中的DNA量的目的。他使用了EB(溴乙錠)作為熒光標記染料,利用了PCR反應中的數學函數關系,再結合加入標準品的方法,達到了對檢測樣品進行準確定量的目的。

1995年美國PE公司成功研制了TaqMan技術,1996年又推出了首臺Real Time PCR檢測系統,使Real Time PCR技術真正得以應用和推廣。近年,Real Time PCR技術不斷完善,取得了突飛猛進的發展,由于其具有操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復性好、污染率低等優點,被廣泛應用于醫學檢測、藥物療效考核、基因表達研究、轉基因研究、基因檢測、病原體檢測、動植物檢測、食品檢測等各種領域。

市面上常見的幾款熒光PCR機型。

 

 

市場主流熒光PCR機型



熒光實時定量PCR定量原理:

PCR每進行1個循環,DNA2倍的指數關系增長,不久達到平臺期。起始DNA量越多擴增產物量便越早達到檢出值,也就是擴增曲線越早起峰。我們將已知濃度的標準品梯度稀釋進行Real Time PCR,就會按照起始DNA量由多到少得順序等間隔得到一系列擴增曲線。再由Ct值與起始模板的對數值之間存在的線性關系,就可以制作成下圖標示的標準曲線。未知濃度的樣品與標準品相同,檢測未知樣品CT值,并將其代人標準曲線,就可以求出未知濃度樣品的起始模板量,這就是Real Time PCR的定量原理。

 

在實時熒光定量 PCR 反應中,引入了一種熒光化學物質,隨著 PCR 反應的進行, PCR 反應產物不斷累計,熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環,收集一個熒光強度信號,這樣我們就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化,從而得到一條熒光擴增曲線。


實時熒光擴增曲線圖

 

PCR的擴增曲線實際上并不是一條標準的指數曲線,而是S形曲線。這是因為隨著PCR循環數的增加,DNA聚合酶的失活,dNTP和引物的枯竭,反應副產物焦磷酸對合成反應的阻害等原因,致使PCR并非一直呈指數擴增,而最終將進入平臺期。

熒光擴增曲線可以分成三個階段:熒光背景信號階段 , 熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段,擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋,無法判斷產物量的變化。而在平臺期,擴增產物已不再呈指數級的增加,PCR 的終產物量與起始模板量之間沒有線性關系,所以根據最終的 PCR 產物量不能計算出起始 DNA 拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段, PCR 產物量的對數值與起始模板量之間存在線性關系,因此應選擇這個階段進行定量分析。

 

重要概念的定義:

1.  什么是基線?

基線就是擴增曲線中的水平部分。


線性基線期為擴展最初的10~15個循環,此時,PCR反應處于起始階段,擴增產物很少,所產生的熒光信號很低。

 

2. 什么是熒光閾值(Threshold)?

PCR反應的前15個循環的熒光信號作為熒光本底信號,熒光閾值的缺省設置是3-15個循環的熒光信號的標準差的10倍,即:Threshold = 10 SDcycle 3-15


3. 什么是CT值?

C代表Cycle,t代表threshold

Ct值的含義是:每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。有實驗證明Ct值大小與樣本中的原始拷貝數成反比關系。Ct值是實時熒光PCR的主要定量參數

 

 

 

4. Ct值與起始模板的關系?

每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系,起始拷貝數越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線,其中縱坐標代表起始拷貝數的對數,橫坐標代表Ct值。因此,只要獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。



 

 

熒光定量PCR標記檢測類型:

1.       內摻式染: SYBR Green I

熒光嵌合法通常使用SYBR Green I。SYBR Green I是一種能夠結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料。它與PCR合成的雙鏈DNA結合,在激發光照射下產生熒光,熒光染料結合到雙鏈DNA后熒光信號增加1000倍,通過熒光強度的檢測,可以實時監測PCR擴增的產物量。


溶解曲線:

采用SYBR Green I熒光嵌合法檢測時,可以通過融解曲線分析,確認PCR反應的特異性。溶解曲線分析是在PCR反應結束后,將PCR反應液的溫度漸漸升高,實時監測SYBR Green I的熒光信號強度變化進行的。起初由于PCR擴增產物呈雙鏈,具有較高的熒光信號強度,隨著溫度的漸漸升高,DNA雙鏈漸漸打開,嵌入DNA中的SYBR Green I數量減少,熒光信號強度就漸漸降低,當雙鏈DNA解鏈一半時,熒光信號強度急劇下降,此時的溫度即融解溫度(Tm值),Tm值與PCR擴增產物的序列有關,對于某一PCR擴增產物,其值是固定的。





 如果出現兩個或以上的峰型,說明有引物二聚體等非特異性擴增產生,需要對反應  條件進行優化或重新設計引物。

 

優點:成本較低,無須對引物或探針進行特殊的熒光標記,操作亦比較簡單 ,適合于篩檢。

缺點:特異性不夠,染料分子會結合到非特異性擴增產生的雙鏈分子和引物二聚體中,使反應體系中的熒光本底較高




2.       序列特異性探針:

 

熒光共振能量轉移(FRET):當一個熒光基團與一個熒光淬滅基團(可以淬滅前者的發射光譜)的距離鄰近至一定范圍時,就會發生熒光能量轉移,淬滅基因會吸收熒光基團在激發光作用下的激發熒光,從而使其發不出熒光。但如果熒光基團一旦與淬滅基團分開,淬滅作用即會消失。所以,利用核酸雜交和核酸水解所致熒光基團和淬滅基團結合或分開的原理,建立各種實時熒光PCR。

a.       Taqman探針:

TaqMan Probe法是使用5’端帶有熒光物質(如:FAM等),3’端帶有淬滅物質(如:TAMRA等)的TaqMan探針進行熒光檢測的方法。當探針完整時,5’端的熒光物質受到3’端的淬滅物質的制約,不能檢出熒光。而當TaqMan探針被分解后,5’端的熒光物質便會游離出來,發出熒光。

PCR反應液中加入熒光探針后,在PCR反應的退火過程中,熒光探針便會和模板雜交,進一步在PCR反應的延伸過程中,DNA聚合酶的5’→3’核酸外切酶活性可以分解與模板雜交的熒光探針,游離熒光物質發出熒光,通過檢測反應體系中的熒光強度,可以達到檢測PCR產物擴增量的目的,具體原理如下圖:


 

 

b.       TaqMan MGB 探針:

能分辨一個堿基的差別。


 

 


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